Expressão do gene da lipase de Ralstonia eutropha em Pichia pastoris
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As lipases são enzimas pertencentes à classe das hidrolases, atuando na interface orgânica-aquosa demonstrando níveis consideráveis de atividade e estabilidade em ambientes aquosos e não-aquosos. Sua função biológica é catalisar a hidrólise de longas cadeias de triacilglicerídeos, formando ácidos graxos e glicerol, além de realizarem esterificação. Possuem vasta aplicabilidade industrial, podendo ser utilizadas na composição de detergentes, na indústria alimentícia, no tratamento de efluentes e em química fina. O objetivo do projeto é clonar e expressar o gene de uma lipase bacteriana na levedura Pichia pastoris. O gene da lipase será isolado por reação em cadeia da polimerase. Os amplicons serão inseridos no vetor de clonagem pCR4 TOPO, multiplicados em Escheria coli, liberados do vetor de clonagem por clivagem com endonucleases de restrição e subclonado no vetor de expressão pPIC9. A levedura será transformada com o vetor recombinante e a expressão da proteína será visualizada em meio sólido contendo o subtrato da lipase. Os clones recombinantes serão inoculados em meio líquido com adição de metanol 0,5% a cada 24h para indução da expressão. A proteína expressa será analisada em gel desnaturante de poliacrilamida e a atividade enzimática será determinada a partir de métodos titulométricos.
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Termo controlado
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